由于宦官魏忠贤专权，杨涟上了一份奏章，揭发魏忠贤二十四条罪状，左光斗等七十余人大力支持，弹劾忠贤等三十二斩罪，但熹宗皆不信。因为移宫案，宦官与东林党势力之间的关系愈加紧张，杨涟弹劾魏忠贤，左光斗和他一起谋划，又和高攀龙一起揭发崔呈秀贪赃，魏忠贤和他的党羽都对他非常怨恨。

等魏忠贤驱逐了赵南星、高攀龙、魏大中以后，接着将驱逐杨涟、左光斗。左光斗很气愤，草拟奏疏，弹劾魏忠贤和魏广微有三十二条当斩罪，准备奏上，预先将妻子遣还原籍。魏忠贤侦知，提前两天将他和杨涟二人一起免职，阉党还不解恨，又制造汪文言案，将左光斗的名字挂上，派差役前往逮治。父老乡亲抱着马头号哭，声震原野，差役也为之流泪，到京后，左光斗被关入诏狱，严刑拷问。

魏忠贤矫旨提问，派许显纯诬陷六君子接受杨镐和熊廷弼的贿赂，判定杨涟、左光斗各坐赃二万，魏大中三千。后左光斗等人被捕下狱，受酷刑折磨，每五天就要受一次审，并受多种刑罚，直至不能跪起，只得卧倒在堂下受讯。魏忠贤诬左光斗等贪污数万两白银，要追出赃款，左光斗的旧友孙奇逢与鹿正、张果中四处募款，诸生热烈响应，募得数千两白银上缴未及，魏忠贤见左光斗有人营救，矫旨仍命许显纯每过五天就追赃拷打一次，不交给法司。

左光斗在牢中遇害，享年五十一岁，被诬陷应交的白银尚未交清，魏忠贤命抚按严加追赃，逮其亲属十四人。长兄左光霁被株连致死，左母因二子俱死，悲痛而卒。都御史周应秋还认为官员追赃不力，上疏催促，因此左光斗、杨琏等人都家破人亡。当魏忠贤编定《三朝要典》时，移宫案以杨涟、左光斗为罪魁，准备开棺戮尸，有人劝解，这才幸免。

明熹宗驾崩，明思宗即位，改元崇祯，惩办阉党，魏忠贤畏罪自杀，思宗追赠光斗右都御史、太子少保，录用其一子为官。